بررسی تمایز سلولهای استرومایی مغز استخوان به سلولهای شبه الیگودندروسایت و پیوند اتولوگ آنها به نخاع ضایعه دیده به روش contusion در موش صحرایی آزمایشگاهی

هدف: از آنجا که تخریب میلین یکی از پیامدهای ضایعات طناب نخاعی (sci) می باشد، ترمیم میلین می تواند یکی از اهداف استراتژی های درمانی مدرن باشد. در مطالعه حاضر سلولهای استرومایی مغز استخوان ( (bmscsپس از تمایز به سلولهای شبه الیگودندروسایت (olcs) به موش های صحرایی مبتلا به ضایعه طناب نخاعی contusion پیوند زده شد و نقش آنها در میلین سازی و بهبودی حرکتی مورد بررسی قرار گرفت. مواد و روش ها: تحت شرایط استریل سلولهای bmscs از استخوان ران موش های صحرایی بالغ استخراج شد. پس از چهار مرحله پاساژ این سلولها در محیط کشت، ابتدا در مرحله پیش القا با استفاده از یکی از القا کننده های dmso ،bme و یا bha همراه با ra (all-trans retinoic acid) سلولهای bmsc به سلولهای شبه نورواپیتلیال (nelcs) تمایز داده شد. سپس در مرحله القا با استفاده از القا کننده های bfgf،pdgf،hrg(heregulin) و سپس دوزهای مختلف triiodothyronine (t) و یا forskolin (f) سلولهای nelcs به سلولهای olcs متمایز شد. در هر دو مرحله پیش القا و القا با استفاده از مارکرهای cd45, cd90, cd44, fibronectin، nestin، nf68، nf160، neurod، oct-4، gfap، mbp ,o4 و s100 با روش های ایمونوسایتوشیمی و rt-pcr اثر این القا کننده ها بر تمایز بررسی گردید. پس از تعیین مناسبترین ترکیب مولکول های القا کننده تمایز bmscs به سلولهای olcs این سلولها برای مطالعات in vivo و پیوند اتولوگ انتخاب گردید. در مرحلهin vivo تعداد 74 سر موش صحرایی ماده بالغ به 8 گروه تقسیم شد. گروه اول یا sham فقط تحت عمل جراحی لامینکتومی در سطح مهرهt13 قرار گرفت، در حالی که در بقیه گروهها پس از لامینکتومی با رها کردن میله 10 گرمی از ارتفاع 5/2 سانتیمتری بر روی نخاع، contusion sci ایجاد شد. در گروه دوم یا شاهد 1 (c1) پس از contusion هیچ درمانی صورت نگرفت. در بقیه گروهها، 7 روز پس از sci تزریق صورت گرفت، به این ترتیب که در گروه سوم یا شاهد 2 (c2) µl9 نرمال سالین به شکل داخل نخاعی (is) در محل ضایعه تزریق شد. گروههای باقیمانده تحت پیوند سلولی قرار گرفتند. در گروه چهارم (e1) سلولهای bmscs تمایز نیافته به شکل is و در گروه پنجم (e2) همین سلولها به شکل داخل وریدی (iv) تزریق گردید و در گروه ششم (e3) به هر دو شکل is و iv تزریق شد. در گروه هفتم (e4) سلولهای olcs به شکل is و بالاخره در گروه هشتم (e5) سلولهای bmscs به شکل iv و سلولهای olcs به شکل is تزریق شد. در همه ی گروهها یک روز قبل از sci تا 12 هفته بعد به طور متوالی بهبودی حرکتی حیوان بوسیله تست bbb مورد بررسی قرار گرفت. در پایان هفته 12 سگمانهای نخاعی t12-l1با استفاده از روش های هیستومورفولوژی و ایمونوهیستوشیمی برای تعیین میزان تغییرات بافتی و چگونگی جایگزینی انواع سلولهای پیوندی در محل ضایعه بررسی گردید. یافته ها: مطالعات ایمونوسایتوشیمی وrt-pcr با استفاده از مارکرهای fibronectin، cd44، cd90، cd45 و oct-4 نشان داد که درصد قابل توجهی از سلولهای کشت داده شده پس از پاساژ چهارم سلولهای bmscs می باشند. بررسی مارکر nestin در پایان مرحله پیش القا نشان داد که ترکیب dmso و ra بهترین تأثیر را در تمایز سلولهای bmsc به سلولهای nelcs دارد. بررسی مارکرهای دیگر به خصوص o4 نشان داد که در مرحله القا ترکیب hrg، pdgf، bfgf و t (10ng/ml) می تواند نقش موثری در تمایز سلولهای nelcs به سلولهای olcs داشته باشد. یافته های بهبودی حرکتی در مرحله in vivo نشان دهنده بهبودی تدریجی و خود بخودی در گروههای کنترل بود. گروههای تجربی سلول درمانی بهبودی حرکتی معنی داری را نسبت به گروههای کنترل داشت. این بهبودی در هفته های دوم تا چهارم مشخص تر بود اما در فاصله هفته های چهارم تا دوازدهم میزان بهبودی کندتر گردید. در گروههای e4 و e5 که سلولهای پیوندی olcs را دریافت کرده بودند، در مقایسه با دیگر گروههای تجربی میزان بهبودی حرکتی به شکل غیر معنی داری بیشتر بود. یافته های هیستومورفومتری نشان دهنده ی کاهش معنی دار حفره و افزایش معنی دار سطح مقطع نخاع در ناحیه مرکزی پیوند در گروههای تجربی e4 و e5 نسبت به گروههای شاهد بود. نتایج همچنین نشان داد تعداد سلولهای پیوندی جایگزین شده در بیشتر نواحی سری و دمی پیوند is به طور معنی داری بیش از iv بود. در همه گروههای تزریق iv، جایگزینی سلولهای پیوندی در مرکز ضایعه با اختلاف معنی داری بیشتر از نواحی سری و دمی مجاور همان گروه بود، و در مقابل در تزریق is تعداد سلولهای جایگزین شده پیوندی در نواحی سری و دمی مرکز ضایعه به طور معنی داری بیش از ناحیه مرکزی در همان گروه بود. بر اساس بیان ژن mbp میانگین درصد سلولهای پیوندی که به سلولهای میلین ساز تمایز یافتند در گروههای e4 و e5 نسبت به گروههای e2, e1 و e3 در موارد متعددی به طور معنی داری بیشتر بود. نتیجه گیری: dmso و ra موجب تمایز سلولهای bmscs به سلولهای نورواپیتلیال، و ترکیب hrg،pdgf،bfgf و (10ng/ml) t موجب تمایز سلولهای نورواپیتلیال به سلولهای شبه الیگودندروسایت می شود. پیوند داخل نخاعی این سلولهای شبه الیگودندروسایت نیز همانند پیوند داخل نخاعی یا داخل وریدی سلولهای bmscs موجب بهبودی حرکتی در ضایعه نخاعی contusion می شود.